Diskisyon kout sou plizyè metòd inik nan fib kre nan enklizyon pirifikasyon Bod

Inclusion Bodies (IB) se gwo dansite, patikil pwoteyin ensolubl ki vlope nan manbràn ki fòme lè jèn etranje yo eksprime nan selil prokaryotik, espesyalman nan Escherichia coli. Lè yo obsève anba yon mikwoskòp, IB se yon rejyon segondè-refraksyon, ki se evidamman diferan de lòt konpozan nan sitoplasm la.

Fòmasyon kò enklizyon se relativman konplèks, ki gen rapò ak pousantaj pwodiksyon pwoteyin nan sitoplasm la, konsantrasyon nan peptides ki fèk pwodwi se wo, epi pa gen ase tan yo pliye, konsa tankou fòme total pwoteyin amorphe. Kò enklizyon yo fondamantalman konpoze de pwoteyin, plis pase 50% nan yo se pwodwi klonaj. Estrikti prensipal la nan pwodwi sa yo konplètman kòrèk, men konfigirasyon an twa dimansyon se mal, kidonk pa gen okenn aktivite byolojik. Gwosè enklizyon kò a se 0.5-1μm, ensolubl nan dlo, sèlman idrosolubl nan denaturants tankou ure, idroklorid guanidine, elatriye.

Nan E. coli, kò enklizyon ka rive nan de kote nan selil la: sitoplasm ak sitoplasm periferik. Kote ak karakteristik kò enklizyon nan selil la depann de fason pwoteyin yo eksprime.

Enklizyon yo nan sitoplasm nan E. coli jeneralman varye an dyamèt soti nan {{0}}.2 a 1.5μm, ak pwoteyin diferan gen dyamèt diferan, tankou gwosè a nan entèferon se 0.811μm, ak gwosè a nan prorennet se 1.281μm. Nan kèk ka, dyamèt kèk kò enklizyon pi gwo pase dyamèt E. coli, ki bay E. coli yon protrusion. An jeneral, yon selil gen yon sèl kò enklizyon.

 

Pirifikasyon kò enklizyon

 

Pwosesis pou pirifye kò enklizyon an jeneralman:

Selil kraze:

Teknoloji jeneral la nan selil kraze se: gwo vitès tisi kraze, homogenizer vè homogenization, tretman ultrasons, repete metòd friz-dekonjle, tretman chimik (jeneralman lè l sèvi avèk tretman lysozyme).

 

Enklizyon lave kò:

Kò enklizyon yo se patikil solid inaktif ki fòme pa aglutinasyon entraselilè nan pwoteyin ki eksprime pa bakteri, ki anjeneral egziste nan fòm amorphe, ensolubl. Nan kò enklizyon an, pwoteyin sib vre a sèlman konte pou apeprè 50%, ak rès la gen lipid, lipopolisakarid, asid nikleyik ak heteroproteins, ki mare nan kò enklizyon an ak afekte renaturasyon nan pwoteyin nan kò enklizyon. Se poutèt sa, lave anvan denaturasyon se yon etap trè nesesè.

Anplis de sa, lave kò enklizyon yo itil pou ogmante pwodiksyon an repliye nan pwoteyin recombinant. Lè yo retire enpurte, obstak nan pwosesis renaturasyon an ka redwi, pou pwoteyin lan ka pliye ak reyini kòrèkteman, kidonk amelyore aktivite ak fonksyon pwoteyin nan.

Lave souvan itilize mwens pase 1% detèjan netral la, tankou Tween, Triton, Urea ak NP40 plis EDTA ak ajan rediksyon 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoethanol repete anpil fwa, paske kapasite lave detèjan amelyore ak ogmantasyon nan fòs iyonik nan solisyon an, nan lave nan enklizyon kò yo ka ajoute NaCl ogmante fòs iyonik la.

Kò enklizyon yo ka itilize pou retire lòt konpozan nan solisyon an pann selil pa santrifujasyon oswa filtraj, tou de nan yo ki pran avantaj de diferan pwopriyete fizik nan kò enklizyon.

 

Santrifugasyon:

Pwoteyin kò enklizyon yo pi dans pase menm volim fragman selil yo, kidonk kò enklizyon an ka separe de rès selil la pa mwayen santrifujasyon. Santrifijasyon kontinyèl se operasyon ki pi souvan itilize pou jwenn kò enklizyon nan pwodiksyon endistriyèl. Depi dansite fragman selil yo pi piti pase kò enklizyon an, to sedimantasyon an pi piti pase kò enklizyon an. Sispansyon kontinyèl ak santrifijasyon ka santrifuje pi fò nan kò enklizyon an, pandan y ap fragman selil yo piti piti retire.
Filtrasyon (filtrasyon tanjansyèl koule): Akòz diferan gwosè molekilè nan kò enklizyon ak pwoteyin idrosolubl, yo ka itilize metòd filtraj la, ki ka diminye depans fonksyònman yo epi fè li fasil pou monte. Tanjansyèl koule filtraj (TFF) kondwi pa diferans nan presyon transmembrane. Sibstans ak enpurte ki pi piti pase gwosè pò a manbràn pase nan manbràn an, pandan y ap enpurte tankou selil ki gen pi gwo patikil yo bloke. Ouverture a manbràn jeneralman yo itilize pou lave filtraj se 0.1μm. Hollow fib tangansyèl koule mikrofiltrasyon ka dirèkteman fè fas ak gwo kontni solid nan materyèl likid, mwens etap, operasyon senp, manbràn la ka itilize repete nan netwayaj, diminye envestisman ekipman ak depans fonksyònman, nan liy ak kondisyon ki nan pwodiksyon modilè otomatik.

 

Sa ki anba la a se yon ka aplikasyon pou enklizyon lave kò lè l sèvi avèk Guidling kolòn fib kre.

Nou te itilize 94cm2 0.1-0.45μm fib kre konsantre 250mL likid (sib pwoteyin pwa molekilè 17kd). Nan pwosesis lave antye, yo te envestige pousantaj rekiperasyon pwoteyin sib ak rediksyon koule manbràn.

0-71min se pwosesis konsantrasyon, 71-224min se pwosesis lave ak filtraj. Pandan tout pwosesis mikrofiltrasyon an, TMP piti piti ogmante, vitès inlet likid la rete san okenn chanjman, ak flux materyèl mwayèn te 12LMH.

Rezilta yo te montre ke pwoteyin sib la te bloke nèt, ak pousantaj rekiperasyon pwoteyin sib la te plis pase 90%. Guidling kolòn fib kre yo ki estab ak apwopriye pou aplikasyon sa a.

 

Disolisyon kò enklizyon:

Kò enklizyon yo jeneralman fonn anba kondisyon denaturasyon ajan ure oswa idroklorid guanidine, ak pwoteyin kò enklizyon ki fonn yo konplètman denatire, se sa ki, eksepte estrikti prensipal la ak lyezon kovalan yo kenbe, tout lyezon idwojèn ak lyezon idrofob yo detwi, ak idrofob. chenn bò yo konplètman ekspoze.

Ure ak idroklorid guanidine se denaturant fòs mwayen, ki fasil retire pa dyaliz ak ultrafiltrasyon. Konsantrasyon jeneral ure 8-10M, guanidine hydrochloride 6-8M. Disolisyon ure gen avantaj ki pa ionizasyon, net, pri ki ba, retire pwoteyin apre renaturasyon pa pral lakòz yon gwo kantite presipitasyon pwoteyin, ak kò enklizyon ki fonn yo ka pirifye pa yon varyete metòd kwomatografi, kidonk li te lajman itilize. .

 

Enklizyon kò pwoteyin repliye:

Pwoteyin recombinant ki fonn yo dwe pliye kòrèkteman pou fòme yon pwoteyin fonksyonèl. Teknik pou renaturasyon gen ladan dilution nan solisyon pwoteyin nan tou pre net, retire denaturant, renaturasyon sou kolòn, ak jèl filtraj kwomatografi. Pami yo, dilution solisyon pwoteyin nan prèske net epi retire denaturant se yon metòd komen klasik nan renaturasyon, espesyalman metòd renaturasyon dilution gen to itilizasyon ki pi wo a.

Retire denaturant:

Dyaliz: Avantaj la se ke volim la pa ogmante, epi li se to retire nan denaturant kontwole pa piti piti diminye konsantrasyon nan likid ekstèn pèmeyab, men li pran yon tan long epi li fasil yo fòme total pwoteyin inaktif, ki pa apwopriye pou operasyon gwo echèl epi yo pa ka aplike nan echèl pwodiksyon an.

Ultrafiltrasyon (TFF): fasil pou kontwole vitès dyaliz la, si nan rechèch ak devlopman, tès pilòt oswa pwodiksyon, ka retire denaturan (chanjman likid + konsantrasyon) atravè ultrafiltrasyon (TFF).

 

Enklizyon pirifikasyon pwoteyin kò:

Metòd pou pirifye pwoteyin apre renaturasyon yo sanble ak sa yo ki pirifye pwoteyin idrosolubl, sètadi kromatografi echanj ion, kwomatografi filtraj jèl, kromatografi afinite, silfat amonyòm sèl-soti presipitasyon, elatriye.

Kò enklizyon pa gen okenn aktivite byolojik, pa gen okenn bezwen enkyete sou pèt la nan aktivite pwoteyin, ak gwo kantite ekspresyon pa pral mennen nan lanmò selil, ak maksimize rezistans nan atak proteaz. Jiuling kre fib ka fleksib aplike nan pwosesis la pirifikasyon en nan kò enklizyon. Nan etap lave lave kò enklizyon, pèfòmans ekselan, konpare ak lave santrifujeur, itilize nan nèf laj teknoloji mikrofiltrasyon fib kre pou lave filtraj koule tanjansyèl ka anpil diminye tan pwosesis la, ak pousantaj rekiperasyon jeneral la ka rive jwenn plis pase 90%. Jiuling kre fib kapab tou itilize nan etap nan renaturasyon pwoteyin nan kò enklizyon. Turbidity nan likid la manje filtre pa mikrofiltrasyon fib kre yo pral siyifikativman redwi, ak pousantaj la rekiperasyon pwoteyin wo; Itilizasyon ultrafiltrasyon fib kre ka pa sèlman retire denaturan, men tou, diminye tan an chaj echantiyon kwomatografik, konsa tankou pou konsève pou tan, diminye volim nan filler ak redwi pri pwodiksyon an. Pousantaj rekiperasyon mikrofiltrasyon / ultrafiltrasyon fib kre varye ak diferan materyèl, ak pousantaj rekiperasyon jeneral la ka rive nan 90-95%.

Teknoloji Guidling akeyi ou pou mande twous tès pou revizyon ki gen rapò.

 

Konsènan Guidling

Guidling Technology se yon antrepriz nasyonal gwo teknoloji ki konsantre sou biopharmaceutique, kilti selil, pirifikasyon ak konsantrasyon byomedsin, dyagnostik ak likid endistriyèl. Nou te devlope avèk siksè aparèy filtre santrifujeur, ultrafiltrasyon ak kasèt mikrofiltrasyon, filtè viris, sistèm TFF, filtè pwofondè, fib kre, elatriye Ki konplètman satisfè senaryo aplikasyon yo nan biopharmaceutique, kilti selil, ak sou sa. Manbràn nou yo ak filtè manbràn yo lajman itilize nan konsantrasyon, ekstraksyon ak separasyon pre-filtrasyon, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ak nanofiltrasyon. Liy anpil pwodwi nou yo, ki soti nan ti, filtraj laboratwa yon sèl-itilize nan sistèm filtraj pwodiksyon, tès esterilite, fèmantasyon, kilti selil ak plis ankò, satisfè bezwen yo nan tès ak pwodiksyon. Guidling Technology ap chèche pou pi devan pou kolabore avèk ou!