Etid sou pwosesis klarifikasyon nan gwo dansite fèmantasyon Lysate nan recombinant Escherichia Coli
Yo nan lòd yo diminye entèferans nan likid materyèl nan chromatografi a ak amelyore rekiperasyon an nan pwoteyin sib, yo te etidye pwosesis la klarifikasyon nan segondè dansite lisat fèmantasyon nan de tansyon nan recombinant Escherichia coli. Yo te chwazi souch BL21-HP1036 ak BL21-palA ki eksprime jèn kle Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis. Pwosesis koule tangansyèl, pwosesis santrifujasyon gwo vitès ak pwosesis klarifikasyon kasèt manbràn yo te itilize pou evalye pwodiksyon an pwoteyin pa deteksyon turbidity ak elektwoforèz.
Rezilta yo te montre ke BL21-HP1036, BL21-palA gwo dansite fèmantasyon lysate eksprime jèn kle nan Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis yo te klarifye pa filtraj kasèt manbràn ak santrifujasyon, ak pwodiksyon an pwoteyin te plis pase 80%, ki ta ka efektivman redwi entèferans kwomatografik la ak amelyore pousantaj rekiperasyon an.
Entwodiksyon
Kounye a, Streptococcus suis (SS) ak Haemophilus parasuis (HPS) se patojèn maladi bakteri ki pi komen nan fèm kochon, ki pote gwo pèt nan endistri kochon. SS ka divize an yon total de 35 serotip 1-34 ak 1/2, ak HPS ka divize an 1-15 serotip, ak de yo souvan melanje, sitou sa ki lakòz poliserozit kochon, atrit, menenjit, andokardit. , septicemia bakteri ak bwonchit.
Akòz gwo kantite serotip Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis, kwa-pwoteksyon ant diferan serotip fèb, ak rezistans antibyotik ap ogmante siyifikativman lè trete ak antibyotik, ki pral afekte efè a terapetik.
Vaksen yo tounen youn nan mwayen efikas pou anpeche SS ak HPS. Gen vaksen inaktive, vaksen atenue, vaksen vivan, vaksen subunit ak vaksen jenetikman, men vaksen inaktive ak vaksen atenue yo sitou sou mache a, ak pwoteksyon iminitè yo bon, men pwoteksyon kwa a pa evidan. Vaksen subunit se yon nouvo kalite vaksen kont streptococcus suis, ki se yon nouvo kalite vaksen ki gen gwo pwoteksyon kwa ak pri ki ba. Rechèch ak devlopman vaksen subunit nan Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis bay yon solisyon pafè a pwoblèm prevansyon ak kontwòl nan Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis ki malè endistri kochon an nan Lachin.
Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis subunit vaksen yo sibi fèmantasyon nan gwo dansite pa recombinant Escherichia coli. Klarifikasyon nan lysate la gen yon gwo efè sou sede pwoteyin sib, men gen kèk rapò ki enpòtan. Ki jan yo reyalize etap la klarifikasyon nan pwosesis fèmantasyon ak pirifikasyon se yon travay enpòtan. Nan papye sa a, recombinant E. coli BL21-HP1036, BL21-palA fèmantasyon segondè-dansite kòm objè a, pou etidye kijan pou redwi efikasman turbidity nan solisyon an klarifye, amelyore sede a pwoteyin, pou Streptococcus suis subunit vaksen fèmantasyon pwosesis pou reyalize teknoloji endistriyèl kraze ak klarifikasyon pou bay baz teyorik ak sipò teknik.
1. Materyèl ak metòd
1.1 Materyèl
1.1.1 Tansyon
Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis souch BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Prensipal medya ak reyaktif
Ekstrè ledven ak marsouin; klori sodyòm; Kanamycin, IPTG; Fòmaldeyid soti nan; Kit jèl SDS-PAGE.
1.1.3 Ekipman tès prensipal la
Fermenter dansite segondè; Santrifij gwo vitès; Aparèy elektwoforèz; Sistèm imaj iltravyolèt jèl; Ékrazan ultrasons; Ti santrifujeur gwo vitès; Iltravyolèt spectrophotometer; Konstan tanperati souke tab la; Ekipman kwomatografi afinite.
1.2 Metòd
1.2.1 Kilti fèmantasyon segondè-dansite
Souch kolifòm rekonbinan ki kalifye BL21-HP1036 ak BL21-pa-lA yo te vaksinen sou mwayen sentetik nan 2% (V/V) epi kiltive nan 37 degre pou 35-40 èdtan.
1.2.2 Pwoteyin recombinant pwovoke ekspresyon
Lè solisyon fèmantasyon an OD{{0}}±0.1, endiksyon an te kòmanse, tanperati endiksyon an te 35 degre ±0.5 degre, epi kilti a te fini apre 10h endiksyon.
1.2.3 Gwo-presyon omojèn kraze ak santrifujasyon
Likid bakteri ki te pase tès inaktivasyon an te kraze pa yon homogenizer presyon ki wo pou fann selil respektivman, ak yon presyon 100 ~ 150 MPa. Apre kraze, likid la kraze te kenbe nan tanperati ki ba.
Supernatant la te jwenn nan santrifijeur ak gwo vitès, vitès santrifujeur: 15000 rpm, kontwòl tanperati: 10 degre ~ 15 degre, vitès piki: 0.5 ~ 1 L / min, respektivman, yo te kolekte surnatant la, ak la. supernatant te ranpli ak resipyan ki retire andotoksin.
1.2.4 Mikrofiltrasyon manbràn kasèt klarifikasyon
Yo te lave manbràn nan ak 10L dlo pirifye nan yon direksyon, epi yo te fè filtraj koule tanjansyèl. Yo te pran 300 mL nan sispansyon bakteri kase apre santrifijasyon an nan santrifujeur tiyo a ak klarifye ak kasèt manbràn mikrofiltrasyon 0.45um. Yo te mezire turbidité pa echantiyon respektivman, ak turbidité a apre santrifujasyon, turbidité nan likid la klarifye nan kasèt la manbràn mikrofiltrasyon ak turbidité nan likid la konsantre nan kasèt la manbràn mikrofiltrasyon yo te konpare. Te kontni an pwoteyin nan echantiyon an detekte pa kwomatografi ak elektwoforèz pou evalye pwodiksyon an pwoteyin.
Etap 2: Rezilta yo
2.1 Done klarifikasyon ak rezilta tès BL21-HP1036 ak BL21-palA pwoteyin
Rezilta yo nan FIG. 1 montre ke turbidite nan BL21-HP1036 ak BL21-palA recombinant Escherichia coli kraze likid diminye soti nan 4 500 NTU ak 4 000 NTU a 1970 NTU ak 520 NTU, respektivman, apre santrifujasyon tib. Te twoub nan BL21-HP1036 ak BL21-palA recombinant Escherichia coli redwi a 25 NTU ak 1.28 NTU pa metòd kasèt manbràn mikrofiltrasyon. Li ka wè ke itilize nan mikrofiltrasyon manbràn kasèt filtraj tanjansyèl koule ak optimize kanal koule louvri gen yon bon efè sou diminye endotoxin, viskozite ak turbidité nan likid kwomatografik pase filtraj la santrifij tradisyonèl, epi li ka siyifikativman redwi kase recombinant E. coli heteroprotein. ak asid nikleyik.
2.2 Pwoteyin rekiperasyon echantiyon BL21-HP1036 ak BL21-palA
Tablo 1 montre ke recombinant Escherichia coli BL21-HP1036 pwoteyin egziste nan tou de solisyon klarifye mikrofiltrasyon an ak surnatant konsantre ki kouvri pa manbràn mikrofiltrasyon an, ak pwodiksyon total pwoteyin apre rekipere pwoteyin nan solisyon an klarifye mikrofiltrasyon ak surnatant konsantre. se anviwon 88.5%. Pwoteyin BL21-palA te egziste tou nan solisyon klarifye eksudat mikrofiltrasyon an ak supernatant solisyon konsantre ki kouvri pa kasèt manbràn mikrofiltrasyon an. Sede total pwoteyin BL21-PALa te 81.5%.
3. Konklizyon
Nan papye sa a, tansyon ki eksprime jèn kle BL{{0}}HP1036 ak BL21-palA nan Streptococcus suis ak Haemophilus parasuis respektivman te sibi fèmantasyon nan gwo dansite epi yo te pase 0.45 twoub likid materyèl la te. siyifikativman redwi pa pwosesis la um microfiltration manbràn kasèt, ki endike ke teknoloji a filtraj tanjansyèl koule ak kasèt manbràn mikrofiltrasyon te pi bon pase sa ki gen gwo vitès santrifujeur, e li ta ka siyifikativman diminye pwoteyin nan enpurte ak asid nikleyik nan kase recombinant Escherichia coli la.
Apre yo fin kolekte likid la klè nan kasèt manbràn mikrofiltrasyon sèl la, te gen 62.9% Kòm 37.1% nan pwoteyin sib la nan BL21-HP1036 te konsantre mikrofiltrasyon oswa egziste nan kasèt manbràn mikrofiltrasyon an ak lòt pèt. , yo te adopte yon metòd de etap pou klarifikasyon. Nan premye etap la, yo te itilize kasèt manbràn mikrofiltrasyon 0.45um pou klarifye ak kolekte exudate la; nan dezyèm etap la, yo te kolekte likid ki rete a konsantre apre santrifijasyon tib, epi li te konbine de etap klarifye likid la kòm echantiyon kwomatografik Valè turbidity likid fèmantasyon BL 21-palA pa ogmante anpil, pwodiksyon pwoteyin lan te kapab rive. plis pase 85.5%, ak sede pwoteyin nan BL 21-Pala fèmantasyon likid te kapab rive nan 81.5% apre tretman de-etap.
Kòm pou kòman yo chwazi kasèt manbràn mikrofiltrasyon an, Guidling Technology ka ba ou bon jan kalite solisyon. Microfiltration manbràn kasèt nou yo ak ultrafiltrasyon manbràn kasèt seri pwodwi itilize polyether sulfone kòm konpayi asirans lan, ki fèt espesyalman pou biotechnologie. Manbràn polyether sulfone nou an gen avantaj ki genyen nan gwo debi, absòpsyon pwoteyin ki ba, segondè fòs mekanik, rezistans enpak ak sou sa. Nou bay ou ak kranpon manbràn espesyal pou mezire presyon an nan inlet la ak priz an tan reyèl, epi yo ka bay vizit teknik selon bezwen ou yo Customize sistèm ultrafiltrasyon espesyal ou / mikrofiltrasyon. Tankou yon ti sistèm koule tanjansyèl ka itilize pou ti, pilòt ak ti-echèl pwodiksyon, epi yo ka totalman lineyè anplifikasyon pou ranpli egzijans tès ou yo ak kondisyon pwodiksyon an.
Konsènan Guidling
Guidling Technology se yon antrepriz nasyonal gwo teknoloji ki konsantre sou biopharmaceutique, kilti selil, pirifikasyon ak konsantrasyon byomedsin, dyagnostik ak likid endistriyèl. Nou te devlope avèk siksè aparèy filtre santrifujeur, ultrafiltrasyon ak kasèt mikrofiltrasyon, filtè viris, sistèm TFF, filtè pwofondè, fib kre, elatriye Ki konplètman satisfè senaryo aplikasyon yo nan biopharmaceutique, kilti selil, ak sou sa. Manbràn nou yo ak filtè manbràn yo lajman itilize nan konsantrasyon, ekstraksyon ak separasyon pre-filtrasyon, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ak nanofiltrasyon. Liy anpil pwodwi nou yo, ki soti nan ti, filtraj laboratwa yon sèl-itilize nan sistèm filtraj pwodiksyon, tès esterilite, fèmantasyon, kilti selil ak plis ankò, satisfè bezwen yo nan tès ak pwodiksyon. Guidling Technology ap chèche pou pi devan pou kolabore avèk ou!
